Dipl.-Biol. Rachel Brandl
Fachgebiet Obstbau und Fachgebiet Botanik

Ziel des Projektes ist es, zukünftig kolumnare Apfelsorten effektiv züchten und selektionieren zu können, indem hocheffiziente Marker bei der frühen Selektion angewandt werden. Diese sollen eine Kombination aus Kolumnarwuchs und anderen gewünschten Eigenschaften wie Krankheitsresistenz und hohe Fruchtqualität detektieren können. Grundlage für diese aussichtsreiche Präzisionszüchtung ist ein DNA-Marker, der vollständig mit dem äußeren Erscheinungsbild kolumnarwüchsiger Pflanzen gekoppelt ist und dieses Merkmal zuverlässig nachweist. Da bereits kleinste Mengen an Testmaterial, wie z.B. ein Blatt eines Sämlings auf ihre genetische Ausstattung geprüft werden können, kann ein so erzeugter genetischer Fingerabdruck erheblich Aufwand und Kosten sparen. Diese Aspekte sind besonders wichtig, da sich der kolumnare Phänotyp erst nach Jahren eindeutig manifestiert. Verschiedene Kreuzungen haben gezeigt, dass der säulenartige Wuchs durch ein einzelnes dominantes Allel des Kolumnargens (Co-Gens) verursacht und vermutlich durch weitere Gene in der Ausprägung modifiziert wird. Erste international durchgeführte Versuche haben zur Generierung von molekularen Markern geführt, die aber zu weit vom eigentlichen Genort auf dem Chromosom entfernt sind und aus züchterischer Sicht keinen besonders hohen praktischen Wert haben, da sie im besten Fall nur zu 97% zuverlässig sind. Trotzdem können sie für das aktuelle Projekt als Startpunkt dienen.

In Deutschland hat sich besonders das Fachgebiet Obstbau der Forschungsanstalt Geisenheim, zunächst unter der Leitung von Prof. Jacob und aktuell unter Prof. Braun, mit der Züchtung von kolumnaren Apfelsorten befasst. Daraus ist die CATS-Serie (Abkürzung für „Columnar Apple Tree System") entstanden. Das Einkreuzen von krankheitsresistenten oder geschmacksintensiven Sorten führt zu eindeutig besseren Sortenformen. Aus diesen kolumnaren und normalwüchsigen Freilandkulturen gelang es dem Fachgebiet Botanik in Zusammenarbeit mit dem Fachgebiet Obstbau, im ersten Projektabschnitt erfolgreich in vitro Kulturen zu etablieren. Diese gewährleisten die jahreszeitenunabhängige Versorgung mit Ausgangsmaterial für die DNA-Isolierung zur Erstellung der Apfel-BAC-Bibliothek („bacterial artificial chromosome", s.u.). Außerdem sind sie die Voraussetzung zur parallel laufenden Entwicklung eines Transformationssystems.

Einblicke in die Erbinformation von Lebewesen wurden erstmals vor über 30 Jahren durch Verfahren zur DNA-Sequenzierung möglich und stellten einen Meilenstein dar. Völlig neuartige, sehr viel schnellere und durch die Anwendung im Hochdurchsatzverfahren auch kostengünstigere Sequenziermethoden („Next-Generation-Sequencing") revolutionieren seit einigen Jahren die Genomforschung. Ein internationales Konsortium befasst sich aktuell als erste Arbeitsgruppe mit der Sequenzierung des Apfel-Genoms der Sorte ´Golden Delicious´ mittels klassischer Sequenzierungsmethoden als auch unter Einsatz der neuartigen Technologien. Da der Apfel weltweit eine der am häufigsten angebauten Obstsorten ist, wird die Veröffentlichung des Genoms mit Spannung erwartet. Die Herausforderung besteht darin, die so gewonnene gewaltige Datenmenge mittels der Bioinformatik zu analysieren und wesentliche Erkenntnisse aus dieser Datenflut zu generieren. Wie auch bei der Entschlüsselung von Genomen anderer Modellorganismen ist damit zu rechnen, dass die Genomsequenz von ´Golden Delicious´ Lücken enthält. Hinzu kommt, dass es sich bei der sequenzierten Sorte nicht um einen kolumnaren Apfel handelt. Unter Umständen können in dem DNA-Bereich, der für dieses Projekt von Interesse ist, Lücken in der gesuchten Region vorhanden sein oder Genomunterschiede zwischen unterschiedlichen Apfelsorten vorkommen. Für die Forschung ist es somit zwingend notwendig, Sequenzinformationen der Geisenheimer kolumnaren Apfelsorte zu bekommen.

Aufgabe der Projektpartner der Universität Mainz ist es, mittels gentechnologischer Methoden die isolierte Erbsubstanz aus der kolumnaren Apfelsorte über ein Vehikel (einen BAC-Vektor) in Bakterienzellen einzufügen und eine so genannte „Apfel-BAC-DNA-Bibliothek" herzustellen. Die Bakterien können von der Apfel-DNA massenhaft identische Kopien herstellen, die hochrein präpariert werden können und somit für weitere Analysen bereitstehen. Mittels dieser Apfel-Genbank und bereits vorhandenen Markern in der ungefähren Nachbarschaft der gesuchten Genregion kann man über molekulargenetische Techniken nach Bakterienklonen von Interesse suchen und sich dadurch schrittweise dem gesuchten Kandidatengen annähern. Die so erhaltenen Sequenzen können wiederum in Geisenheim an vorhandenen Kreuzungspopulationen getestet und für die Generierung zuverlässiger Marker benutzt werden.

Um zu garantieren, dass die neuen DNA-Sequenzen in der gesuchten Genregion liegen, kann man diese DNA als Sonde mit einem Fluoreszenzfarbstoff markieren und deren Lage auf dem Chromosom durch Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) sichtbar machen. Durch Vergleiche mit bekannten Referenzmarkern (Tian et al. 2005), die das gesuchte Co-Gen beidseitig flankieren, hat man eine visuelle Kontrolle über die Position auf dem Chromosom.

In mehreren Doktorarbeiten, die ebenfalls am Institut für Molekulargenetik in Mainz angefertigt werden, wird momentan untersucht, welche Gene in kolumnaren versus nicht-kolumnaren Apfelpflanzen aktiv sind. Im Gegensatz zu der Erbinformation, der DNA, die in einer bestimmten Zelle zu jedem Zeitpunkt vorhanden ist, zeigt das Vorhandensein der Abschrift dieser DNA (dem Transkript, RNA, Ribonukleinsäure) die Aktivität eines Gens zu einem bestimmten Zeitpunkt, in einem bestimmten (physiologischen) Zustand an. Für diesen Untersuchungsansatz der Transkriptomanalyse wird angenommen, dass das Transkriptmuster in Apikalmeristemen der Triebspitzen kolumnar versus nicht-kolumnar wachsender Apfelbäume unterschiedlich ist, da allen biologischen Vorgängen eine komplexe Genregulation mit fördernden und hemmenden Wechselwirkungen vorangeht. Ein direkter Vergleich der Transkriptome zwischen der normalwüchsigen und der kolumnaren Sorte könnte so einen Hinweis auf die molekulare Wirkungsweise des Co-Gens geben. Gene, die im kolumnaren Organismus vermehrt transkribiert werden, im normalwüchsigen aber nicht, können direkt oder indirekt mit dem Co-Gen in Verbindung gebracht werden. Diese möglichen Kandidatengene werden für eine Funktionsanalyse in Geisenheim mittels der quantitativen Real time-PCR auf differentielle Genaktivität überprüft und können bioinformatisch durch Datenbankanalysen mit anderen Genen verglichen werden.